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動物疫苗培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)
2019-04-28 16:10
【概要描述】動物細胞的離體培養(yǎng)一直是科學家們十分重視的研究領域。從1907年美國人Harrison將蝌蚪的神經(jīng)組織體外培養(yǎng)成功以后的近一個世紀里,動物細胞培養(yǎng)在動物病毒研究及疫苗生產(chǎn)中起了非常重要的作用。通過動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng),得到了許多極有價值的生物物質(zhì),如疫苗、診斷試劑、干擾素和單克隆體等,為人類的健康提供了有利的保障。20世紀80年代后期“組織工程”概念的提出,動物細胞的三維培養(yǎng)又成為了一個重要的研究
動物細胞的離體培養(yǎng)一直是科學家們十分重視的研究領域。從1907年美國人Harrison將蝌蚪的神經(jīng)組織體外培養(yǎng)成功以后的近一個世紀里,動物細胞培養(yǎng)在動物病毒研究及疫苗生產(chǎn)中起了非常重要的作用。通過動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng),得到了許多極有價值的生物物質(zhì),如疫苗、診斷試劑、干擾素和單克隆體等,為人類的健康提供了有利的保障。20世紀80年代后期“組織工程”概念的提出,動物細胞的三維培養(yǎng)又成為了一個重要的研究課題,它使科學家們夢寐以求的目標即體外重建人體組織逐步成為可能。
動物細胞的培養(yǎng)大致有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)等方式。在動物細胞的培養(yǎng)過程中,細胞培養(yǎng)生物反應器是整個過程的關鍵設備,它要為細胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。按照動物細胞的生長要求,具備低的剪切效應、較好的傳遞效果和流體力學性質(zhì)是這類反應器設計或改進所必須遵循的原則。
1 攪拌式生物反應器
攪拌式反應器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力,它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性,因此在生物反應中被廣泛使用。但由于動物細胞沒有細胞壁的保護,因此對剪切作用十分敏感,直接的機械攪拌很容易對其造成損害,傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應器用作動物細胞的培養(yǎng)顯然是不合適的。所以,動物細胞培養(yǎng)中的攪拌式反應器都是經(jīng)過改進的,包括改進供氧方式、攪拌槳的形式及在反應器內(nèi)加裝輔件等。
1.1 供氧方式的改進
一般情況下,攪拌式反應器還常伴有鼓泡,為細胞生長提供所需氧分。由于動物細胞對鼓泡的剪切也很敏感,所以人們在供氧方式的改進上做了許多工作。
籠式供氧(cageaeration)是攪拌式動物細胞反應器供氧方式的一種,即氣泡用絲網(wǎng)隔開,不與細胞直接接觸。反應器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力,以滿足細胞生長的要求。北野昭一報道了一個經(jīng)過改進的攪拌式動物細胞反應器,整體呈梨形,攪拌置于反應器底部,在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)內(nèi)側鼓泡,絲網(wǎng)外側的細胞不與氣泡直接接觸。
Gelligen反應器是美國NBS公司(NewBrunswick Scientific Co.)生產(chǎn)的適合于微載體系統(tǒng)的細胞反應器。反應器中有一個中空的導向攪拌槳,培養(yǎng)液和細胞通過中空導向槳形成上下循環(huán)。反應器采用籠式供氧,溶于液體中的氧依靠絲網(wǎng)外液體的對流作用均勻分布到反應器內(nèi)。該反應器還帶有一個氣體調(diào)節(jié)系統(tǒng),用來控制溶氧濃度和pH值。由于氣泡不與細胞直接接觸,所以通氣量不受限制,而且泡沫少不需用消泡劑,細胞在循環(huán)過程受到的剪切力也很小。華東理工大學生化工程研究所開發(fā)的CellCul-20動物細胞培養(yǎng)反應器,主要工作原理與Gelligen反應器相似,但采用了雙層籠式供氧,提高了氧的傳遞系數(shù)。在20L的反應器中采用灌流工藝培養(yǎng)Vero細胞,連續(xù)培養(yǎng)5天細胞數(shù)增加37倍,密度超過1×107個/mL。
還有其他一些改進的供氧方式。Lavery等用一個帶有雙層攪拌的反應器測量了動物細胞培養(yǎng)介質(zhì)中氧的傳遞。攪拌軸是中空的,氣體從軸的底部通入,經(jīng)下層槳葉攪拌,均勻地分散于液體中：上層槳葉抑制了液面處氣泡的迸濺,從而減小了對細胞的損害。
Sucker等介紹了一種帶攪拌的鼓泡反應器,能在動物細胞的培養(yǎng)中將氣泡對細胞的損害降到最小。反應器中央液面下方有一個氣液混合管,里面裝有鼓泡器和攪拌器。液體與鼓泡器出來的氣體在混合管內(nèi)逆流混合,然后在攪拌槳的作用下流出混合管在反應器內(nèi)形成循環(huán)。他們設計了3種不同形式的混合管,目的是為保證混合管內(nèi)的氣泡只能浮于管口而盡可能不進入培養(yǎng)液。實驗中在2.4L反應器中的培養(yǎng)效果與100mL的spinner瓶相近。
1.2 攪拌槳的改進
攪拌槳的形式對細胞生長的影響非常大,這方面的改進主要考慮如何減小細胞所受的剪切力。Kaman等對攪拌槳的形式作了改進,并在反應器內(nèi)加裝了輔件，實驗證明改進后的反應器適用于對剪切力敏感的細胞進行高密度培養(yǎng)。反應器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳(helicalribbon impeller),頂部的法蘭蓋上安裝了3塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為30°,垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個反應器維持了較小的剪切力,實驗中用于昆蟲細胞的培養(yǎng),最終的培養(yǎng)密度達到6×106個/mL,成活率在98%以上。
2 非攪拌式生物反應器
攪拌式生物反應器用于動物細胞培養(yǎng)存在的最大缺點是剪切力大,容易損傷細胞,雖然經(jīng)過各種改進,這個問題仍很難避免。相比之下,非攪拌式反應器產(chǎn)生的剪切力較小,在動物細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強的優(yōu)勢。
2.1 填充床反應器
填充床(packed bed)是在反應器中填充一定材質(zhì)的填充物,供細胞貼壁生長。營養(yǎng)液通過循環(huán)灌流的方式提供,并可在循環(huán)過程中不斷補充。細胞生長所需的氧分也可以在反應器外通過循環(huán)的營養(yǎng)液攜帶,因而不會有氣泡傷及細胞。這類反應器剪切力小,適合細胞高密度生長。
Park等人在由填充床反應器和外循環(huán)裝置構成的連續(xù)流動的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)動物細胞。反應器中的填料是帶有微孔的陶瓷珠粒,細胞在微孔內(nèi)生長,同時培養(yǎng)液也可以在孔內(nèi)擴散。實驗證明該反應器適于動物細胞的高密度培養(yǎng),細胞終期密度達到了5×108個/mL。
Chiou等人在以聚氨酯和纖維素泡沫為填料的填充床反應器中培養(yǎng)昆蟲細胞,證明這兩種微孔材料適合昆蟲細胞的生長且不易脫落。在兩類填充床中高密度培養(yǎng)的細胞其最終平均密度達到了4.3×107和5.2×107個/mL。
John等在以玻璃纖維作環(huán)形填料的氣升式填充床反應器中模仿鼠類骨髓細胞生長環(huán)境培養(yǎng)細胞,證明這類反應器可以用于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。Cong等人用微載體培養(yǎng)提供種子細胞,也在填充床反應器中成功實現(xiàn)了CHO細胞的大規(guī)模培養(yǎng),最大細胞密度達到了2×107個/mL。
2.2 中空纖維反應器
中空纖維反應器(hollow fiber bioreactor)由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng)。這類反應器由中空纖維管組成,每根中空纖維管的內(nèi)徑約為200μm,壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2等小分子可以自由透過膜擴散,動物細胞貼附在中空纖維管外壁生長，可以很方便地獲取氧分。
John等報道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的徑向流中空纖維反應器。該反應器內(nèi)有一個垂直的中央分配管,外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床,細胞在中空纖維外壁貼附并生長?？諝夂虲O2的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層,向細胞提供氧分并維持一定的pH值環(huán)境,細胞的代射物隨氣流帶出。在這個反應器中細胞生長的表面密度可達7.3×106個/cm2。
Guinn發(fā)明了一個可用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應裝置,由中空纖維反應器和灌流系統(tǒng)組成。液體通過泵在反應系統(tǒng)內(nèi)循環(huán),灌流系統(tǒng)補充或置換培養(yǎng)介質(zhì)及移出代謝物。細胞在中空纖維膜的一側生長,培養(yǎng)介質(zhì)在膜的另一側通過擴散向細胞傳遞營養(yǎng)。該反應器能為細胞提供一個溫和的生長環(huán)境。
Gebhard的發(fā)明也是一個用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器,用泵控制培養(yǎng)介質(zhì)在反應器內(nèi)循環(huán)。培養(yǎng)液在中空纖維腔內(nèi)流動并通過中空纖維膜向另一側供應細胞生長所需的養(yǎng)分。該反應器可控制溶氧、介質(zhì)組成、溫度和pH值,適合于細胞的高密度懸浮培養(yǎng),尤其適合于動物細胞。
Gramer介紹了小型的中空纖維動物細胞培養(yǎng)反應器,由氧滲透膜管和中空纖維束構成內(nèi)外空間,供細胞生長和向細胞提供營養(yǎng)。細胞培養(yǎng)密度幾乎能達到2×108個/mL。該反應器可用于為大規(guī)模中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)預測不同介質(zhì)、培養(yǎng)條件及其他因素對細胞生長可能產(chǎn)生的影響。
2.3 氣升式生物反應器
氣升式生物反應器(airlift bioreactor)也是實現(xiàn)動物細胞高密度培養(yǎng)的常用設備之一,其特點是結構簡單,操作方便。戴曉萍等人在氣升式反應器中利用微載體培養(yǎng)技術,研究了Vero細胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應器中懸浮微載體培養(yǎng)Vero細胞,在加入適量保護劑、營養(yǎng)供應充足的情況下,細胞可以正常生長至長滿微載體表面,終密度可達1.13×106個/mL。
香港大學的Wen等人報道了一個新型的灌流裝置,由氣升式反應器和澄清器組成,用于高密度培養(yǎng)動物細胞。在灌流循環(huán)中,細胞經(jīng)過兩級沉降回到反應器,平均培養(yǎng)密度達到了1.31×107個/mL。
3 其他類型的反應器
除上述類型的反應器外,一些其他類型的適于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器也時有報道。
Kleis等人設計了一個“粘性泵生物反應器”(viscous pump bioreactor),它以“三維流動”代替攪拌混合,提供較高的傳質(zhì)速率。反應器的底部是提供動力的流線型轉(zhuǎn)盤,培養(yǎng)液在反應器中以水平運動和螺旋的縱向運動形成“三維流動”。由于轉(zhuǎn)盤和反應器頂部都為流線型而沒有鋒利的邊緣,所以產(chǎn)生的剪切力很小。
一篇美國專利介紹了一種膜式旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)器,由一個培養(yǎng)室和一個供應室組成,中間隔有一層半透膜。營養(yǎng)物可以從供應室透過膜進入培養(yǎng)室,細胞代謝物也可以通過膜進入供應室。培養(yǎng)器中的混合裝置在培養(yǎng)器旋轉(zhuǎn)時保證細胞在培養(yǎng)室中溫和混合并穩(wěn)定懸浮。培養(yǎng)室與氧源之間的氣體滲透膜使氧分能透過膜擴散溶于液相。該裝置產(chǎn)生的剪切力很小,適合于細胞高密度地培養(yǎng)。另一篇美國專利介紹了一個組合式細胞培養(yǎng)器,帶有膜的培養(yǎng)室插在供應室中,通過定位裝置可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)室的位置。該培養(yǎng)器適合于細胞或組織的培養(yǎng)。
Tsao發(fā)明了一個帶有拱形培養(yǎng)室的細胞培養(yǎng)生物反應器,空氣不與細胞直接接觸,氧分通過氣體滲透膜向培養(yǎng)介質(zhì)中溶解。培養(yǎng)室可以繞軸旋轉(zhuǎn),拱形的結構減小了對細胞的剪切,尤其適合于動物細胞的培養(yǎng)。
陶祖萊等人發(fā)明了一個用于組織工程的雙軸旋轉(zhuǎn)式細胞/組織三維培養(yǎng)器,由內(nèi)筒培養(yǎng)液流動室、細胞培養(yǎng)室和外筒氣室的3個套筒組成,有利于細胞和組織三維生長及O2、CO2、營養(yǎng)物和代謝物的傳遞。他們還發(fā)明了一種可調(diào)控應力的旋轉(zhuǎn)式細胞/組織三維培養(yǎng)器,也是三套筒結構。培養(yǎng)器內(nèi)剪應力隨著細胞聚集體的形成,可以從零調(diào)控至培養(yǎng)細胞或組織的生物應力。
Saha報道了一個新型的動物細胞培養(yǎng)反應器(“see-saw” bioreactor)。反應器由兩個獨立的筒狀培養(yǎng)室構成,底部用管路聯(lián)通。通過培養(yǎng)室頂部的三通閥在壓縮和放空間切換,培養(yǎng)液在培養(yǎng)室間作類似“拉鋸”的運動。由于粘性的作用,液面下降時液體在器壁上拉伸成膜,增大了與空氣的接觸面積,有利于氧的傳遞。實驗在3種切換時間下(20s、25s、30s),溶解氧的實測值均比理論濃度高。反應器中沒有攪拌和鼓泡的作用，所以對細胞的損傷很少。
此外,脈沖式生物反應器(pulsatile bioreactor)也是用在組織培養(yǎng)中的一種新型反應器。營養(yǎng)液通過脈沖灌流進入反應器,脈沖的頻率和強度可調(diào),借以模擬動物體內(nèi)的生物應力。
4 結語
動物細胞培養(yǎng)的關鍵設備是細胞培養(yǎng)反應器,上面所介紹的幾類都有各自的特點。但不論是改進的還是新型的,主要解決的共性問題都是要按照動物細胞的生長要求,使反應器具備低的剪切效應、良好的傳遞效果和流體力學性質(zhì)。但在實際過程中,這些原則總有一些相互制約的因素,為了強化傳遞效果需要有一個充分的混合環(huán)境(包括氣體鼓泡),但動物細胞的脆弱性制約了這個環(huán)境的形成;為提高培養(yǎng)介質(zhì)中的溶氧度需要有較高的氧分壓,不過,高的氧分壓也影響了代謝物的移出。同時,過高的氧分壓也影響細胞的正常生長。如何優(yōu)化這些制約,是這類反應器開發(fā)中要解決的問題。在動物細胞培養(yǎng)中,反應器的改進大多針對攪拌式反應器。雖然這類反應器剪切力大,但由于它混合均勻、結構簡單、操作方便以及良好的傳遞效果和操作彈性,在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中仍占有重要的位置。
目前,研究工作要致力于開發(fā)高密度細胞培養(yǎng)反應器,提高細胞生產(chǎn)率或生物產(chǎn)物的濃度。尤其組織工程的迅速發(fā)展,對動物細胞生物反應器有了不同要求。要保持細胞離體培養(yǎng)時能具有同體內(nèi)一樣的三維異性結構、維持分化細胞的功能并支持細胞的高密度生長,培養(yǎng)過程要考慮種植有細胞的三維基質(zhì)支架和生物反應器所組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。事實上,一種反應器的開發(fā)不可能滿足動物細胞生長的所有要求,同時也不可能適合所有的細胞培養(yǎng)方式。所以,根據(jù)某種細胞的培養(yǎng)過程或細胞的某種培養(yǎng)方式,開發(fā)專用反應器也許會比通用反應器有更好的效果。
天匯公司可以為科研單位和企業(yè)提供生物技術中試及工業(yè)規(guī)模動物疫苗培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)車間工程建設的全套服務。服務內(nèi)容有系統(tǒng)設計（包括基建、公用工程、全套設備、管閥、自空儀表設計），定型設備選型，非標設備制造，安裝、調(diào)試、生物技術中試項目上馬的技術支持。
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